Ensamblaje de genes: secuenciación de ADN de fragmentos del tamaño de genes mediante el uso de Primer Walking

La secuenciación Next Generation (Next-Gen) es una nueva forma de tecnología capaz de determinar la secuencia de ADN del tamaño de un genoma bacteriano. A pesar de esta capacidad para secuenciar millones de bases, la tecnología Next-Gen no siempre es eficiente o rentable. La secuenciación de fragmentos más pequeños de ADN es un ejemplo de esto. A veces, los investigadores prefieren secuenciar un solo gen para determinar la función o llenar los vacíos que dejan las tecnologías más avanzadas. El primer caminar es una práctica común que todavía se emplea para secuenciar regiones más pequeñas de ADN. Los secuenciadores capilares han mejorado la capacidad de secuenciar el ADN con tiempos más rápidos y longitudes de lectura de bases más largas. Sin embargo, el proceso básico de iniciación a caminar y ensamblaje de genes sigue siendo el mismo.

Aislamiento del fragmento de ADN

El primer paso para secuenciar un fragmento de ADN seleccionado es aislar el fragmento del ADN genómico. El aislamiento a menudo se realiza amplificando copias de la región elegida usando PCR (reacción en cadena de la polimerasa). La PCR produce copias de (amplifica) una región de ADN determinada por oligonucleótidos monocatenarios más pequeños llamados cebadores. Los cebadores se recogen hasta el punto de inicio en el filamento delantero y el punto de inicio en el filamento inverso a medida que la amplificación avanza en ambas direcciones. La amplificación por PCR produce millones de copias de una región determinada de ADN. Sin embargo, requiere el conocimiento de la secuencia antes y después de la región para seleccionar cebadores para la amplificación.

Los investigadores a veces eligen secuenciar el fragmento de ADN (producto de PCR) directamente. Sin embargo, muchos investigadores prefieren la clonación utilizando un plásmido bacteriano como alternativa.

Amplificación del fragmento de ADN en un plásmido bacteriano

Una vez que el ADN seleccionado ha sido amplificado por PCR, se inserta en un plásmido bacteriano . El plásmido es una molécula de ADN circular con secuencia conocida. El ADN circular se rompe con enzimas de restricción que permiten insertar el fragmento de ADN desconocido. La mayoría de los plásmidos comerciales contienen imágenes universales desde las cuales los investigadores pueden seleccionar cebadores universales para secuenciar el ADN insertado en las direcciones directa e inversa. Los secuenciadores capilares generalmente generan 800 a 900 bases para cada cebador para un conjunto único de reacciones de secuenciación que producen 1600 a 1800 bases totales de datos. Esto puede cubrir todo el inserto para fragmentos de ADN más pequeños. Sin embargo, los genes generalmente tienen más de 5 bases 000. Por lo tanto, un conjunto de resultados de secuencia no completaría la secuenciación de todo el fragmento de ADN.

Los resultados de secuencia proporcionan plantillas para cebadores

El ensamblaje de genes y el recorrido de cebadores implican el uso de una secuencia conocida para seleccionar cebadores para datos de secuencia adicionales. El uso de un resultado generado a partir de un cebador universal proporciona la plantilla de secuencia para diseñar el próximo cebador. El cebador probablemente se seleccionará alrededor de la región base 700 para obtener un resultado con 800 bases de secuencia de calidad. Las bases restantes 100 permitirán la superposición con la nueva secuencia generada. La marcha del cebador continúa hasta que los resultados de la secuencia directa se cruzan con los resultados de la secuencia inversa. Una inserción de base 5, 000 probablemente necesitaría de 5 a 8 resultados para lograr la superposición entre las direcciones hacia adelante y hacia atrás. Los investigadores pueden secuenciar las cadenas tanto hacia adelante como hacia atrás por completo para proporcionar la secuencia completa de la molécula bicatenaria para confirmar la precisión de todas las bases.

El software ensambla los resultados de la secuencia

Existen programas de software comerciales diseñados para ensamblar los resultados de la secuencia en el orden de sus regiones superpuestas, lo que resulta en un secuencia de consenso. Muchos de estos programas usan datos de cromatogramas que permiten revisar y corregir las llamadas de pico de base si es necesario. El cromatograma es una vista de los datos reales que muestran la calidad de los picos generados durante la electroforesis. Algunos programas simplemente usan el texto de las llamadas base, pero esto no permite una revisión tan detallada de los resultados.