Desarrollo histórico de secuenciación automatizada utilizando el método Sanger

La secuenciación automática ha sido una técnica utilizada desde los primeros 1980 s. Aunque la tecnología ha cambiado dramáticamente desde su primer uso, la química básica todavía se usa comúnmente en la actualidad. Se basa en cuatro pasos básicos: purificación de ADN, amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), separación por electroforesis y análisis.

Sanger s Dye Terminator Chemistry

Aunque se desarrollaron varios métodos durante el 1970 s, el método de terminación de tinte inventado por Fred Sanger es el método aceptado utilizado en la secuenciación automática. El paso de amplificación en la PCR combina una mezcla de bases de ADN sin procesar (dNTP) y bases que causan la terminación (ddNTP). La ventaja de usar ddNTP es que varios productos de ADN amplificados durante la PCR terminan una vez que se agrega el ddNTP. Esto crea una serie de productos que son diferentes por una sola base. El producto final es una sopa combinada que contiene productos que varían desde aproximadamente 19 bases en longitud hasta cientos de bases, cada una diferente por una sola base. En los medios de separación, el número total de productos aparecería como una escalera. Además, los ddNTP están etiquetados para permitir la detección.

Inicialmente se usó radioactividad en el método Dye-Terminator

Cada ddNTP que representaba una de las cuatro bases de ADN también contenía una etiqueta radiactiva . Los productos amplificados se separaron en medios mediante electroforesis. Luego se retiraron los medios y se fotografiaron para ver la secuencia base de la muestra. Sin embargo, el problema con este método era que no había forma de detectar una diferencia entre el ddNTP que etiquetaba una base G versus A, C o T. Por lo tanto, era necesario amplificar la muestra en cuatro reacciones separadas en las que solo una base ddNTP era presente. Un tubo terminaría solo cuando la secuencia tuviera la base G, mientras que los otros tres tubos etiquetados como A, C o T.

Teniendo esto en cuenta, cuatro reacciones separadas se cargarían por separado en el medio. Cada base aparecería como una escalera incompleta. El investigador que realiza la secuencia necesitaría dibujar una línea a través de cuatro carriles separados en los medios para determinar la secuencia de las cuatro bases.

Etiquetas fluorescentes reemplazadas Radioactividad

El requisito de usar cuatro carriles para determinar una secuencia pronto se reemplazó con etiquetas fluorescentes en los ddNTP. Cada ddNTP que representa una de las cuatro bases se marcó con un fluoróforo diferente que se detectaría como un color diferente: verde para As, azul para Cs, rojo para Ts y amarillo para Gs. Se eliminó la necesidad de cuatro carriles. Esto amplió la capacidad de secuenciar muestras cuatro veces.

Además, un sistema capaz de detectar las bases también se desarrolló a principios de 1980 s, poco después de que Sanger desarrolló el método Dye-Terminator. Las muestras se cargaron en el mismo medio utilizado inicialmente para el método radiactivo. Luego fueron instalados en una máquina que funcionaría con electroforesis. Esto proporcionó una segunda ventaja. Ya no era necesario mantener la escalera de base en el gel para fotografiar más tarde. En cambio, cuando cada banda que representa una base alcanzaba el punto final en los medios, la máquina automatizada fotografiaría el color y enviaría esta información a una computadora. Una vez completado, los medios simplemente se descartaron de manera apropiada. Esto permitió determinar más productos amplificados aumentando la capacidad del método radiactivo dos veces más.

El equipo de secuenciación automatizada ha evolucionado

La separación de los productos radiactivos de la amplificación de ADN se realizó mediante un procedimiento llamado electroforesis. Esencialmente, se vertió un reactivo llamado acrilamida entre dos placas de vidrio donde se polimerizaría en una matriz similar a un gel llamada poliacrilamida. Las muestras se cargarían en la parte superior de la matriz y la corriente eléctrica haría que el ADN migrara a través del gel. Los productos pequeños migran más rápido que los productos grandes cuando se aplica una corriente eléctrica porque incurre en menos resistencia.

Se utilizó el mismo proceso cuando se desarrollaron los primeros secuenciadores automáticos. Con el tiempo, esta tecnología continuó mejorando para que los investigadores pudieran determinar piezas más largas de ADN y cargar más muestras. En general, la tecnología cambió muy poco hasta la invención de los secuenciadores capilares. Delgados capilares de vidrio reemplazaron las voluminosas placas de vidrio. Ya no era necesario verter geles. En cambio, se inyectó un nuevo polímero automáticamente cada vez que se cargaron muestras. Aún mejor fue la cantidad de tiempo para ejecutar una muestra promedio. La electroforesis en gel de placa de vidrio puede tomar más de 12 horas para determinar una secuencia de bases 400 o 500. Los capilares de vidrio podrían hacer el mismo trabajo en poco más de 2 horas.

Al igual que la electroforesis en gel de placa (placa de vidrio), la secuenciación capilar ha seguido desarrollando métodos más rápidos para secuenciar más muestras. El resultado general es tremendo en comparación con los secuenciadores automáticos originales.

Hoy, la ciencia ha seguido desarrollando mejores métodos para secuenciar el ADN. La secuenciación de próxima generación tiene la capacidad de secuenciar un genoma completo de dos megabases en unos pocos días. Este mismo trabajo requeriría incluso los secuenciadores Sanger de más alta tecnología meses de preparación y procesamiento. Esto no significa que los secuenciadores automáticos serán reemplazados. Todavía existe una gran necesidad de secuenciar piezas de ADN más cortas a un costo total sustancialmente menor.